Trabajo Individual (III)

III. MÉTODOS EXPERIMENTALES

III.1.- Muestras, disolventes y disoluciones
Nuestro objetivo es estudiar el comportamiento de la delfinidina frente al pH y calcular su constante de ionización extrayendo esta sustancia de diferentes plantas, pero para las pruebas iniciales y puesta a punto del método se usan productos comerciales que no han necesitado purificación posterior. Estos productos se han mantenido en las condiciones especificadas por la casa comercial durante su almacenamiento. Los tampones y otros productos químicos eran de la casa Merck.
Las disoluciones madre se han preparado por pesada, con una precisión superior a
±0,05 mg, y a partir de ellas y utilizando disoluciones tampón se han preparado disoluciones de concentraciones en torno a 10-3 M con fuerza iónica 0,01 M.
Las disoluciones de trabajo han sido preparadas a partir de las anteriores por dilución, utilizando disoluciones tampón de distintos pH como eluyente, con objeto de barrer toda la escala de pH para la determinación de los pK de las sustancias.
Una vez preparadas las disoluciones, éstas se han mantenido en la oscuridad, habiéndose comprobado que estas son unas buenas condiciones de almacenamiento, ya que los espectros obtenidos tiempo después de su preparación, no varían respecto a los obtenidos con las disoluciones recién hechas.

III.2.- Métodos de extracción de colorantes naturales de las flores: delfinidina
Para la extracción de la delfinidina de las plantas se han macerado pétalos de las flores seleccionadas (hortensia, violeta, pensamientos, etc) en diversos disolventes. Como disolvente se han utilizado agua caliente por encima de 80ºC o mezclas formadas por un disolvente orgánico y agua, especialmente alcoholes de bajo peso molecular. Se recomienda el uso de etanol, metanol, pentano, hexano, heptano, acetona, acetato de etilo, así como una mezcla de los mismos o mezclas acuosas. Se recomienda como temperatura de extracción de 60 a 80ºC. Es aconsejable realizar la extracción bajo atmósfera inerte para evitar la oxidación de los productos.
Los tiempos de extracción se ajustarán según el material de partida, el procedimiento de extracción, la temperatura a la que se realiza, y otros factores como la concentración del disolvente.
A modo de ejemplo indicar que para realizar la extracción es suficiente emplear 24 horas, a una temperatura de 40-60ºC, utilizando una disolución acuosa de etanol para extraer la delfinidina de los pétalos de las flores.

IV.- RESULTADOS

IV.1.- Variación del color con el pH
Para el estudio de la variación del color con el pH, se ha utilizado tetrabromofenol
sulfonftaleína es decir azul de bromofenol.
Hemos realizado un barrido en toda la escala de pH con objeto de encontrar los posibles equilibrios ácido-base para cada una de las sustancias. Sólo se ha apreciado el cambio descrito en la bibliografía, el cual se encuentra entre los pH 3 y 6.
-Análisis de los espectros
Se han preparado diversas disoluciones a 25 ºC, de concentración 2,1810-5 M de azul de bromofenol a distintos pH, diluyendo volúmenes iguales de disolución madre con diferentes tampones (pH= 1, 2, 3, ..., 13).
En la figura 10, se muestran los espectros entre pH = 1,21 y pH = 11,784.


Figura 10: Espectros del tetrabromofenol sulfonftaleína a diferentes pH.
El tetrabromofenol sulfonftaleína presenta un color amarillo a pH ácido, con una banda de absorción a 430 nm, que disminuye su intensidad al aumentar el pH, apareciendo una nueva banda en torno a pH = 2,5 cuyo máximo se encuentra a 588 nm. Esta banda incrementa su intensidad hasta llegar a pH=8, donde se estabiliza. En este caso existe un punto isobéstico que se encuentra a 500 nm, indicando con ello, la existencia de un equilibrio ácido-base.
A partir de pH = 12, la intensidad de las bandas disminuye con el tiempo, debido a un proceso de decoloración.

V.- DISCUSIÓN

V.1 Discusión de resultados de la variación de los parámetros cromáticos con el pH
V.1.1 Variación de las coordenadas triestímulos con el pH para disoluciones de tetrabromofenol sulfonftaleína.
Los resultados obtenidos a partir de los espectros de la figura 10, se presentan en la tabla I.

	X	Y	Z
pH = 1,210	0,8507	0,9274	0,4980
pH = 2,123	0,8354	0,9122	0,4944
pH = 2,711	0,7737	0,8430	0,4973
pH = 3,032	0,7186	0,7830	0,5160
pH = 3,598	0,5766	0,6116	0,6058
pH = 4,003	0,4708	0,4720	0,6784
pH = 4,407	0,4256	0,3893	0,8145
pH = 5,111	0,4156	0,3460	0,9512
pH = 6,146	0,4121	0,3227	1,0176
pH = 7,063	0,4128	0,3196	1,0345
pH = 7,990	0,4153	0,3208	1,0472
pH = 8,996	0,4127	0,3192	1,0336
pH = 9,807	0,4145	0,3206	1,0416
pH = 10,270	0,4137	0,3203	1,033
pH = 11,784	0,4203	0,3280	1,0498

TABLA I: Coordenadas triestímulos a diferentes pH para el tetrabromofenol sulfonftaleína.

Estos datos se representan gráficamente en la figura 11. En esta sustancia, observamos que tanto la coordenada X, como la coordenada Y presentan una variación similar y que, la coordenada Z varía de forma inversa.
La coordenada X permanece constante hasta un pH =
2, donde comienza a decrecer hasta un pH = 5, en el que se vuelve a producir de pequeña variación.
La coordenada Y varía igual, salvo que presenta un descenso más abrupto.
La coordenada Z permanece en una situación estable hasta un pH = 2,5, en el que incrementa su valor, hasta un pH =6, donde al igual que en los casos anteriores vuelve a permanecer estable.

Figura 11: Variación de las coordenadas triestímulos con el pH para el tetrabromofenol sulfonftaleína.

Sobre pH = 12 se produce un ligero aumento de las coordenadas triestímulos en el tetrabromofenol sulfonftaleína, debido al proceso de decoloración

V.1.2 Variación del color en los diagramas cromáticos con el pH.
A) Variación en el diagrama CIE 1931.
Los datos de la evolución de las coordenadas cromáticas en el diagrama cromático
CIE 1931, se muestran en la tabla II, para disoluciones de tetrabromofenol sulfonftaleína.
Tabla II: Evolución del tetrabromofenol sulfonftaleína con el pH.

	x	y
pH = 1,210	0,3737	0,4075
pH = 2,123	0,3726	0,4069
pH = 2,711	0,3660	0,3988
pH = 3,032	0,3561	0,3881
pH = 3,598	0,3214	0,3409
pH = 4,003	0,2904	0,2911
pH = 4,407	0,2612	0,2389
pH = 5,111	0,2426	0,2020
pH = 6,146	0,2352	0,1841
pH = 7,063	0,2336	0,1809
pH = 7,990	0,2329	0,1799
pH = 8,996	0,2338	0,1808
pH = 9,807	0,2333	0,1805
pH = 10,270	0,2341	0,1812
pH = 11,784	0,2337	0,1824

En la figura 12, se muestra la evolución de las coordenadas x e y para disoluciones de tetrabromofenol sulfonftaleína (TS) en el sistema CIE 1931. La evolución se inicia en la zona de amarillos llegando hasta la zona de los púrpuras. Este comportamiento se comentó igualmente para las coordenadas triestímulos.

Figura 12: Variación en el diagrama cromático CIE 1931 para el tetrabromofenol sulfonftaleína con el pH.

B) Variación del color en el diagrama CIELAB 1976.
En la tabla III se recogen los datos de todos los parámetros cromáticos medibles al utilizar este sistema cromático.
Las figuras 13, 14,15 y muestran respectivamente: la evolución de los parámetros a y b, y la luminosidad, la cromaticidad y el ángulo de matiz, respectivamente, con el pH, para el tetrabromofenol sulfonftaleína.

	a	b	L*	C*	H*
pH = 1,210	-10,633	45,024	97,123	46,263	103,25
pH = 2,123	-10,841	44,308	96,502	45,615	103,71
pH = 2,711	-10,223	38,987	93,583	40,307	104,65
pH = 3,032	- 9,966	32,525	90,915	34,018	107,00
pH = 3,598	- 5,447	9,623	82,466	11,058	119,48
pH = 4,003	2,294	-10,580	74,320	10,826	102,19
pH = 4,407	13,551	-30,720	68,699	33,576	113,77
pH = 5,111	24,650	-45,731	65,435	51,951	118,29
pH = 6,146	31,649	-53,189	63,562	61,893	120,72
pH = 7,063	32,943	-54,674	63,312	63,831	121,04

Figura 13: Variación de los parámetros a* y b* con el pH para el tetrabromofenol sulfonftaleína.

Observamos en la figura 13 un punto de intersección al evolucionar las coordenadas a
y b con el pH en la gráfica. La proyección de este punto de intersección sobre el eje X, corresponde a un valor de pH que se encuentra cercano al punto de equilibrio. Dicho valor de pH corresponderá de forma aproximada al pKa del equilibrio ácido-base. Si al representar simultáneamente los parámetros a y b de disoluciones de una sustancia frente al pH, se producen cortes entre las curvas ello indicará la existencia de dos especies distintas –forma ácida y forma básica- de un equilibrio ácido-base.
Esta será, por tanto una forma cualitativa de reconocer la existencia de posibles equilibrios ácido-base.

Figura 14: Variación del parámetros luminosidad con el pH para el tetrabromofenol sulfonftaleína.

La luminosidad presenta una evolución en forma de "S", similar a una curva de valoración ácido-base.


Figura 15: Variación del parámetro cromaticidad con el pH para el tetrabromofenol sulfonftaleína.
Los parámetros cromaticidad y ángulo de matiz presentan mínimos frente al pH, en torno al punto de equilibrio de la sustancia, presentando valores constantes en zonas alejadas de dicho punto de equilibrio. Ello es debido a las relaciones matemáticas que existen entre estos parámetros, y su relación con a* y b*.

Figura 16: Variación del ángulo de matiz con el pH para el tetrabromofenol sulfonftaleína.


V.2.- Discusión de resultados en la determinación de los pK
Se ha calculado el pKa a partir de valores de la absorbancia de las especies ácida y básica y de bastantes valores de la absorbancia (de los espectros obtenidos a pH intermedios a los anteriores) donde coexistían ambas especies en equilibrio. Se han tabulado estos valores de absorbancia, a varias longitudes de onda, para cada uno de los equilibrios estudiados.
También se incluyen los cálculos de pKa realizados. Estos se han hecho utilizando las absorbancias a pH a los que existen claramente forma ácida (AA) y forma básica (AB), además se ha empleado la absorbancia (A) a un pH intermedio a los anteriores cuyos espectros quedasen lo más intermedio posible a los de la forma ácida y básica, con objeto de disminuir los errores de redondeo ya que en el cálculo intervienen diferencias de absorbancia de magnitudes parecida.

-Método colorimétrico para el cálculo de pK
La tabla IV muestran los incrementos cromáticos a distintos pHs para el tetrabromofenol sulfonftaleína.
TABLA IV: Variación de la diferencia cromática del tetrabromofenol sulfonftaleína con el pH.

	ΔC*	(ΔC*)'
pH = 1,210	0,000	108,675
pH = 2,123	0,746	108,104
pH = 2,711	6,051	103,001
pH = 3,032	12,514	97,059
pH = 3,598	35,779	74,769
pH = 4,003	57,087	53,591
pH = 4,407	79,511	30,721
pH = 5,111	97,372	12,107
pH = 6,146	106,928	1,880
pH = 7,063	108,805	0,027
pH = 7,990	109,499	0,825
pH = 8,996	108,858	0,041
pH = 9,807	109,129	0,212
pH = 10,270	108,675	0,000

Se han tomado 4 datos intermedios en el tetrabromofenol sulfonftaleína, realizándose un ajuste lineal cuyas ecuaciones son: ΔC = -137,10 + 48,76 * pH, con R = 0,997 y (ΔC)' =
245,41 - 48,24 * pH, y un valor de R = 0,996. La proyección de la intersección de ambas rectas sobre el eje X, nos da un valor de pK = 3,943, figura 17.

Figura 17: Variación de la diferencia cromática para el cálculo de pK.

El método colorimétrico utilizado consideramos que es el más adecuado en la determinación de pK, ya que:
•Utiliza todo el espectro y no solamente valores de absorbancia a una, o a unas pocas longitudes de onda. De alguna forma, cuando se multiplican los valores de
transmitancia a intervalos de 5 nm. por los coeficientes equienergéticos, se está introduciendo un "peso" a cada valor de transmitancia según sea su longitud de onda, y se está haciendo, de alguna manera un cálculo del área de la envolvente espectral.
•No es necesario tener la certeza absoluta de que el equilibrio este desplazado hacia la forma ácida y/o básica, como exigen los métodos espectrofotométricos, ya que son suficiente valores de a* y b* obtenidos a pHs próximos al pK.
•Con la ayuda de colorímetros comerciales (que dan directamente valores de L*, a* y b*) se pueden determinar pK de forma bastante rápida.
•La única limitación del método viene determinada por la necesidad de que las disoluciones de las muestras sean coloreadas, (es decir, absorban en la zona visible).
Los otros métodos espectrofotométricos presentan el inconveniente de utilizar valores de absorbancia, de distintas disoluciones de pHs intermedios, a una sola longitud de onda del espectro (la del máximo). Además exigen asegurar, mediante la reproducibilidad de los espectros, que el equilibrio está totalmente desplazado hacia la forma ácida, para obtener AA, y hacia la forma básica, para obtener AB. Considerar que en un momento dado el equilibrio está totalmente desplazado en uno u otro sentido puede conducir a valores erróneos de AA y AB, y por consiguiente, en el pK.

VI.- CONCLUSIONES
A continuación se relacionan las principales conclusiones y resultados a las que se ha llegado en la primer parte de la investigación: 1. Proponemos la utilización del método de 79 ordenadas para el cálculo de los valores
triestímulo, frente a los métodos que utilizan menor número de ordenadas, ya que cuantos más términos tengan las sumatorias, mejor convergerá hacia el valor de la integral.
2. Hemos utilizado un método de cálculo de constantes de ionización de compuestos coloreados basado en medidas de color en el espacio cromático CIELAB para el cálculo de la constante de ionización del azul de bromofenol (colorante utilizado como indicador y como diagnóstico de la función renal). Presenta las siguientes ventajas respecto a los métodos espectrofotométricos:
•Utilización de todo el intervalo espectral visible (380-770 nm) lo que produce resultados más fiables.
•Cálculos de pKa muy rápidos, aplicables a colorímetros comerciales que por lectura directa dan L*, a* y b*).
•Sólo son necesarias cuatro medidas a pHs próximos al valor del pKa sin necesidad de tener que confirmar (a pHs extremos) que el equilibrio está totalmente desplazado, en uno u otro sentido, como exigen los métodos espectrofotométricos.
•También la cromaticidad y el ángulo de matiz CIELAB, se pueden utilizar para el cálculo del pKa, así como cualquier otro parámetro cromático relacionado también con las magnitudes a* y b*, y que, por tanto, varían con el pH.

VII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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