3ª Evaluación

1) EXTRACCIÓN DE ADN DE CÉLULAS ANIMALES

MATERIAL:

- Hígado de pollo - Lavavajillas

- Mortero - Zumo de piña

- Pipeta - Papel de filtro

- Probetas - Varillas de vidrio

- Alcohol etílico de 96º - Embudos

FUNDAMENTO:

En nuestro experimento nos centraremos en extraer ADN de células animales. El proceso de extracción del ADN genómico sigue ciertas pautas para su correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación de proteínas, lo que refleja las diferencias básicas en la estructura de estos dos tipos de macromoléculas. El primer paso en la purificación del ADN por lo general consiste en homogeneizar las células y aislar los núcleos de los cuales se extrae el ADN. El medio de extracción ordinario contiene un detergente, lo que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación. El objetivo de los pasos de purificación es separar el ADN de materiales contaminantes, como ARN y proteínas. Luego los ácidos nucleicos se precipitan añadiendo etanol (alcohol). Para concluir el análisis de la extracción del ADN hay que resaltar que en este proceso ocurre una lisis celular lo cual significa que el ADN queda libre, por consiguiente, hay que protegerlo de las enzimas porque estas podrían degradarlo. En nuestro experimento utilizaremos higadito de pollo y alcohol etílico de 96º.

MÉTODO EXPERIMENTAL:

Tritura un higadito de pollo en un mortero. Añade al triturado 200 ml de agua destilada y remueve hasta hacer una especie de papilla. La papilla debe quedar opaca, nunca transparente.
Filtra varias veces la papilla en un embudo con papel de filtro sobre una probeta. Vierte la pasta que queda en el filtro en otra probeta y anota el volumen (20 ml).

Añade una cantidad de detergente (5 ml en nuestro experimento) equivalente a una cuarta parte del volumen de la pasta. Remueve suavemente hasta que la pasta quede homogénea.

Añade 10 ml de zumo de piña y sigue removiendo la mezcla unos cinco minutos.

Vierte la mezcla en otra probeta más ancha y añade poco a poco con una pipeta 50 ml de alcohol frío. El alcohol debe resbalar por las paredes de la probeta para evitar que se mezcle con la pasta.

Dejar reposar la mezcla sin agitar ni remover. Al cabo de unos minutos verás que se forman dos fases: en el fondo estará el agua con las proteínas y en la parte superior estará el alcohol con el ADN en forma de filamentos blancos. Sumerge la varilla de vidrio solo en la parte del alcohol y muévela siempre en la misma dirección hasta que los filamentos blancos se adhieran a la varilla.

¡Ya has extraído el ADN del hígado.

Añade azul de metileno y observa las fibras al microscopio.

CUESTIONES:

1) Sabiendo que el detergente crea un medio hipertónico y que emulsiona los lípidos, ¿qué efecto crees que tiene sobre las membranas nucleares?

- Romperá la pared celular y la membrana celular para que el núcleo celular libere el ADN.

2) Sabiendo que el zumo de piña es rico en una enzima llamada papaína. ¿Qué efecto crees que tiene sobre la pasta de hígado?

- La papaína es una enzima que hidroliza y descompone las enzimas del hígado para homogeneizar la célula.

3) ¿Qué tipo de sustancia crees que es el azul de metileno para adherirse a los filamentos de ADN?

- Es un colorante o pigmento que se fija en los enlaces nucleotídicos.

4) Describe el ADN.

- El ácido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN es un tipo de ácido nucleico. Contiene la información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria.

2) SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL (pendiente)

MATERIALES

- Mortero

- Tijeras

- Espinacas u hojas verdes

- Embudo con papel de filtro

- Tubo de ensayo en gradilla

- Éter etílico

- Alcohol metílico puro (cuidado, sus vapores son muy tóxicos)

- Cápsula de Petri o vaso de precipitados

- Capilar o micropipeta (cuentagotas en su defecto)

- Tira de papel cromatográfico Wathman (con un buen papel de filtro se obtiene, incluso mejores resultados).

INTRODUCCIÓN

Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores: clorofila-a (verde intenso), clorofila-b (verde), carotenos (rojo-anaranjado) y xantofilas (amarillo anaranjado) en diferentes proporciones.

FUNDAMENTO

Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad en disolventes apolares, lo que permite su separación cuando una solución de las mismas asciende por capilaridad a través de una tira de papel poros (papel de cromatografía o de filtro) dispuesta verticalmente sobre una película de un disolvente orgánico (etanol), ya que las más solubles se desplazarán a mayor velocidad, pues acompañarán fácilmente al disolvente a medida que éste asciende. Las menos solubles avanzarán menos en la tira de papel de filtro.

Aparecerán, por tanto, varias bandas de diferentes colores (hasta siete o más, dependiendo del material utilizado) que estarán más o menos alejados de la disolución alcohólica según la mayor o menos solubilidad de los pigmentos. Estas bandas poseerán diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolución.

TÉCNICA

- Colocar en un mortero trozos de hojas lavadas, quitando las nerviaciones más gruesas, junto con 10 o 15 cc de éter etílico.

- Triturar sin golpear hasta que el líquido adquiera una coloración verde intensa (utilizar campana de gases a lo largo de toda la prácticas).

- Filtrar en un embudo con papel de filtro y recoger en un tubo de ensayo (es suficiente con 2 o 3 cc. de solución de pigmentos).

- Colocar en la tapadera de una caja de Petri metanol absoluto hasta una altura de 0,5 a 1 cm.

- Cortar una tira de papel de filtro de unos 8 cms. de anchura y unos 10 a 15 cms. de altura.

- Poner con el capilar en el papel de cromatografía entre 5 y 10 gotas de solución de pigmentos, espaciadas en el tiempo con el fin de que vaya secándose el éter etílico y aumente la cantidad de pigmentos. Las gotas se pondrán siempre en el mismo punto (se puede marcar con un lápiz), situado a nos 2 cm por encima del borde inferior del papel.

- Doblar el papel cromatográfico a lo largo y colocarlo en la placa de petri con la mancha de pigmento a 1 cm. de la superficie del eluyente. Podemos sustituir la placa de petri por un vaso de precipitados y fijar el papel cromatográfico con una pinza a un soporte horizontal colocado en el borde del vaso (por ejemplo, una varilla de vidrio).

- Esperar unos 30 minutos y observar.

CUESTIONES Y RESULTADOS

1) La solubilidad en alcohol de los pigmentos es, de mayor a menor: carotenos, clorofila a, clorofila b y xantofila. Indicar qué pigmento corresponde a cada banda.

2) ¿Por qué empleamos éter etílico para extraer la clorofila?

3) ¿Qué pigmentos son los más abundantes?